400-830-9659
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
Mouse IL-27 ELISA Kit |
ABC0045-48T |
48T |
ABC0045-96T |
96T |
產(chǎn)品簡介
IL-27屬于IL-12家族成員,主要由抗原提呈細胞,包括樹突狀細胞、巨噬細胞等在微生物或其他免疫刺激物刺激下產(chǎn)生,其受體廣泛分布于多種免疫細胞。IL-27是一種異源二聚體細胞因子,由激活的抗原呈遞細胞所分泌。IL-27有著促炎癥和抗炎癥的作用。它通過促進幼稚CD4+ T細胞向Th1特異譜系的早期提交而促成炎癥。與此相反,它又抑制Th17分化并在分化的Th1和Th2效應細胞中誘導調節(jié)性T細胞(Tr1)的活性而抑制炎癥。這些細胞分泌的IL-10有著抗炎癥免疫抑制作用,可能作為一種負反饋機制,平衡IL-27誘導的Th1分化。IL-27是一個多效細胞因子,作為一種免疫激活劑,IL-27可以防止癌癥和感染性疾病的發(fā)展;而作為免疫調節(jié)劑,IL-27可抑制自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。IL-27在治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫病上是一個有吸引力的候選靶點。Mouse IL-27 ELISA Kit通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附技術,體外定量檢測小鼠血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關液體中的IL-27,可同時檢測天然的和重組的小鼠IL-27。
儲存與運輸
冰袋運輸;4℃保存,有效期12個月;開封后需在4周內用完。
需準備的材料設備
1. 能夠檢測450 nm吸光度的酶標儀,參考波長630 nm(建議參考儀器使用說明提前預熱);
2. 單道或多道移液器及吸頭,加樣槽,離心管;
3. 蒸餾水或去離子水;
4. 干性濾紙或吸水紙;
5. 渦旋混勻儀,微孔板振蕩器。
樣本的采集與保存
1. 血清樣本:采集血樣,靜置30分鐘,血液凝固。取液體部分進行離心分離,1000 g離心15分鐘,吸取上清即可檢測,或者分裝,分裝上清置于-20℃以下保存,避免反復凍融。
2. 血漿:用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑收集血漿樣本,并將樣本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000 g離心15分鐘,吸取上清即可檢測,或者分裝,分裝上清置于-20℃以下保存,避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)上清:300 g離心10分鐘,吸取上清即可檢測,或者分裝,分裝上清置于-20℃以下保存,避免反復凍融。
注意:
1. 樣本如果渾濁,必須離心去除沉淀物,不適用嚴重溶血或高血脂的樣本。
2. 以上樣本均需密封保存,4℃保存不超過1周,-20℃保存不超過1個月,-80℃保存不超過2個月。
3. 冷凍樣本使用前應緩慢平衡至室溫。
試劑的配制
1. 提前20分鐘將試劑盒及樣本從冰箱中取出,平衡至室溫。按實驗需求取出本次實驗所需板條和試劑,每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
2. 1×洗液配制:取25×濃縮洗液30 mL至1 L的量筒,加蒸餾水或去離子水至750 mL,輕輕混勻。轉移至干凈瓶內。
3. 標準品配制:將稀釋液A按照標簽標注體積加入標準品中,輕柔渦旋振蕩,確保充分混勻。重溶后的標準品濃度為8000 pg/mL,即為濃縮的小鼠IL-27標準品。重溶后靜置10分鐘,稀釋前充分混勻。
a) 血清/血漿樣本標準曲線制備:
充分混勻重溶后的標準品,取500 μL濃縮的小鼠IL-27標準品,加入500 μL稀釋液A,作為標準曲線的最高濃度S7(4000 pg/mL)。取6個1.5 mL離心管(S1-S6)依次排列,各加入500 μL稀釋液A。吸取500 μL S7(4000 pg/mL)標準品到第一個離心管S6中,輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中,輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0為稀釋液A。
b) 細胞培養(yǎng)上清樣本標準曲線制備:
充分混勻重溶后的標準品,取500 μL濃縮的小鼠IL-27標準品,加入500 μL細胞培養(yǎng)基,作為標準曲線的最高濃度S7(4000 pg/mL)。取6個1.5 mL離心管(S1-S6)依次排列,各加入500 μL細胞培養(yǎng)基。吸取500 μL S7(4000 pg/mL)標準品到第一個離心管S6中,輕輕吹打混勻。從S6中吸取500 μL到第二個離心管S5中,輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0為細胞培養(yǎng)基。
4. 1×檢測抗體配制:檢測抗體短暫離心,用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度?;靹蛑瞥?×檢測抗體工作液,臨用前配制。
5. 1×SA-HRP配制:SA-HRP短暫離心,用稀釋液B按照1:100倍稀釋至工作濃度。混勻制成1×SA-HRP工作液,臨用前配制。
注意:
1. 未開封的試劑盒:未拆封的試劑盒可整盒保存于4℃,有效期12個月。
2. 已開封的試劑盒:有效期4周,凍干標準品溶解后不能再次使用,剩余試劑及時放置4℃保存。此外,請將未使用的板條用包含干燥劑的鋁箔袋裝好,并拉緊密封鋁箔袋,置于4℃保存。
操作步驟
1. 加樣:分別設標準孔、待測樣本孔、空白孔。用稀釋液A稀釋標準品及樣本,設標準孔7孔(S1-S7),每孔依次加入100 μL不同濃度的標準品,空白孔每孔加入100 μL稀釋液A,余孔每孔加入待測樣品100 μL,封板膜封板,100-300 rpm振蕩(保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可),室溫振蕩孵育2小時;
注意:請先查閱相關文獻確定樣本中待檢測蛋白的大致濃度,如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度,請進行適當稀釋或濃縮后再檢測。
2. 洗板:自動洗板或手工洗板,每孔洗滌液為300 μL,注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將酶標板倒扣在吸水紙上適當用力拍干,棄去孔內液體;
3. 加檢測抗體:用稀釋液B將檢測抗體稀釋至工作濃度,每孔加1×檢測抗體工作液100 μL(臨用前配制),更換新的封板膜封板,100-300 rpm振蕩(保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可),室溫振蕩孵育1小時;
4. 洗板:重復步驟2;
5. 加SA-HRP:用稀釋液B將SA-HRP稀釋至工作濃度,每孔加1×SA-HRP工作液(臨用前配制)100 μL,更換新的封板膜封板,100-300 rpm振蕩(保證每孔溶液不灑出且能充分混勻即可),室溫振蕩孵育30分鐘;
6. 洗板:重復步驟2;
7. 加顯色液TMB:每孔加TMB底物溶液90 μL,更換新的封板膜,室溫避光顯色(反應時間應控制在10-30分鐘,不要超過30分鐘。當標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止);
8. 加終止液:每孔加終止溶液50 μL,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不均一情況,請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻;
9. 讀數(shù):在確保酶標板底部無水滴及孔內無氣泡后,10分鐘內用檢測波長450 nm讀值。推薦用雙波長即檢測波長450 nm、參考波長或校正波長630 nm同時讀值,僅使用450 nm讀值會降低準確度。
注意事項
1. 試劑盒按說明書保存,使用前室溫平衡20-30分鐘。
2. 標準品為凍干粉,所需加入的稀釋液體積及稀釋倍數(shù),請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。為保證標準品的精確性,標準品配制使用后,如果有剩余請勿再次使用。
3. 25×洗液在低溫下可能有結晶,如果發(fā)現(xiàn)有結晶,請37℃溫育使結晶完全溶解后再配制成工作液。
4. TMB對人體有刺激性,操作時請注意適當防護,避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸,請立即用大量清水清洗。
5. 試劑盒中的終止液為酸性溶液,操作時請注意適當防護,避免試劑直接接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸,請立即用大量清水清洗。
6. 如果發(fā)現(xiàn)顯色液TMB出現(xiàn)混濁或顏色變成藍色,請立即停止使用。
7. 不宜混用不同批號的試劑盒組份,每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試,不能混用。
8. 本試劑盒的操作在室溫進行,要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。
9. 檢測標準品和樣品時建議設置重復孔,以確保檢測結果的可信度。
10. 在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強光照射。
11. 加樣過程中需避免氣泡的產(chǎn)生。
12. 在操作試劑盒或處理樣本時請穿實驗服,佩戴乳膠或一次性手套。
13. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅。
14. 為了避免微生物的污染及試劑與樣本間的交叉污染,加樣時請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭。
15. 洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干,濾紙上看不到水印。勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。
結果分析
1. 結果計算
為了獲得更準確的實驗結果,建議標準品及樣本進行復孔檢測。計算標準品和樣本的平均OD值,然后減去空白孔的OD值。
以標準品濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線,相關系數(shù)R值越接近1,擬合效果越好。回歸分析確定最佳擬合曲線。
代入樣本檢測OD值,計算出樣本濃度,若樣本進行了稀釋,應乘以稀釋倍數(shù),即為樣本的實際濃度。
通過對濃度值和OD值取對數(shù)擬合,可以對標準曲線進行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度,但數(shù)據(jù)的準確度會降低。
2. 典型數(shù)據(jù)
每次檢測每塊酶標板都必須設立單獨的標準曲線。由于實驗操作條件的不同(如操作者、洗板條件和溫度條件等),每次實驗標準曲線的OD值會有所差異。說明書提供的標準曲線僅供參考。
pg/mL |
OD |
Average |
Corrected |
|
4000 |
2.143 |
2.121 |
2.132 |
2.047 |
2000 |
1.217 |
1.142 |
1.180 |
1.095 |
1000 |
0.583 |
0.652 |
0.618 |
0.533 |
500 |
0.251 |
0.293 |
0.272 |
0.187 |
250 |
0.139 |
0.186 |
0.166 |
0.091 |
125 |
0.128 |
0.138 |
0.133 |
0.048 |
62.5 |
0.119 |
0.101 |
0.11 |
0.025 |
0 |
0.088 |
0.082 |
0.085 |
|
檢測步驟概要
1. 實驗前按說明書準備標準品、試劑及樣本;
2. 加樣(標準品或樣本)100 μL/孔,室溫振蕩2小時;
3. 洗滌5次后拍干,加檢測抗體工作液100 μL/孔,室溫振蕩1小時;
4. 洗滌5次后拍干,加SA-HRP工作液100 μL/孔,室溫振蕩30分鐘;
5. 洗滌5次后拍干,加TMB底物90 μL/孔,室溫避光孵育10-30分鐘;
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