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單細胞測序,不是只有BD和10×Genomics

文章出處:行業(yè)資訊責任編輯:愛必勝生物科技(東莞)有限公司 發(fā)表時間:2023-04-20

      單細胞測序技術指的是通過高通量測序技術(NGS,Next Generation Sequencing)分析每一個單個細胞的序列信息,從而更高分辨率地揭示細胞間的細胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況。
 
為什么要做單細胞測序
       單細胞測序發(fā)展的十余年,使得我們所認知的這個世界越來越精準。我們傳統(tǒng)的測序方法,是在組織水平或者說多細胞水平上進行的,最終得到的數(shù)據(jù)其實是從多個或者多類細胞中得到的平均值,但是無法明確細胞異質性的信息。而單細胞測序,則能夠在更精細的單個細胞水平上獲得遺傳信息,從而揭示每個細胞的基因結構和基因表達狀態(tài),反映常規(guī)測序所無法得到的異質性信息和稀有細胞的遺傳信息。因此也有人稱單細胞測序為NGS的“顯微鏡”。
徐1.jpg圖1. 單細胞測序發(fā)展歷程
 
單細胞測序技術的難點
      單細胞測序最大的局限性在于待測核酸的含量,如一個細胞里的DNA或RNA含量僅僅處在皮克 (picograms) 級水平,遠遠達不到現(xiàn)有建庫試劑盒的最低投入量需求。因此,必須先對單細胞內的微量核酸分子進行擴增,而且必須保證盡可能少地出現(xiàn)技術誤差,以便開展后續(xù)的測序及其它研究。其次高通量單細胞測序需要增加捕獲效率,提高靈敏度。除此之外,樣本處理過程中對于稀有樣本的獲取和難解離組織的細胞分離,也是很大的挑戰(zhàn)。
 
主要的幾種單細胞測序技術

 基于微流控液滴的10× Genomics

      10×genomics 公司的 Chromium 系統(tǒng),利用微流控技術將細胞自動分配到 100,000到 1,000,000微反應體系,每個微反應體系含有一種特定的 barcode 序列;含有 barcode 信息的凝膠珠子(GEMs)首先與樣品和酶的混合物混合,然后與位于微流體「雙十字」連接中的油表面活性劑溶液結合;GEMs 流到儲液器中并進行收集。凝膠珠子溶解釋放barcode 序列,開始對樣本進行標記;最后將每個液滴中含有 barcode 信息的產(chǎn)物混合,然后構建標準測序文庫。


      10×genomics的優(yōu)勢在于細胞通量高,建庫周期短,操作簡便,具有超高的捕獲效率。不足之處在于只能獲得3’端的轉錄本信息,且樣本要求高。
徐2.jpg圖2. 10×genomics測序原理

 

 基于微孔板的BD Rhapsody

      BD Rhapsody 技術利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標記微球上實現(xiàn)單細胞捕獲和 mRNA 轉錄本的分子標簽,然后將這些微球合并到單個管中用于 cDNA 擴增和文庫構建??蓾M足 100~10,000 個細胞的自動分選、擴增及建庫。此外,該技術使用帶有寡核苷酸的高質量抗體(Ab-oligos),這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼,細胞在經(jīng)過 Ab-oligos 標記后,可在單細胞水平同時獲得轉錄組和蛋白表達。
相比于10×genomics,BD Rhapsody在捕獲效率和有效性上有一定優(yōu)勢。
徐3.jpg圖3. BD Rhapsody測序原理

 

 基于PCR擴增的Smart-seq技術

      Smart-Seq(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一項具里程碑意義的技術。細胞被裂解后,將RNA與包含oligo(dT)的引物雜交。然后添加幾個無模板的C核苷酸,生成第一條鏈。這種poly(C)垂懸只添加到全長轉錄本上。然后將寡核苷酸引物與poly(C)突出雜交,合成第二條鏈。全長cDNA經(jīng)過PCR擴增,以獲得納克級的DNA。PCR產(chǎn)物純化后可用于測序。在后來又有學者對該技術進行改進,新方案使用鎖核酸(LNA)、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿。它不再需要純化步驟,可大大提高產(chǎn)量。
      Smart-seq相比較于10×genomics檢測到的轉錄本更多,但是不足在于測序reads無法實現(xiàn)鏈特異性,同時由于對聚腺苷酸化的RNA具有選擇性,因此不適用于分析非poly(A)的RNA。
徐4.jpg

圖4. Smart-seq測序原理
 

 基于線性擴增的MARS-seq技術

      通過 T7 啟動子連在 oligo dT 引物上,可以在 cDNA 合成后啟動 IVT(in vitro transcription ),MARS-seq 2.0 是在 MARS-seq 基礎上,整合 index 分選以及大量平行單細胞 RNA測序方法,從而形成的一套流程。
徐5.jpg圖5. MARS-seq測序原理
 
單細胞測序技術發(fā)展前景
       2013年,單細胞測序技術被《Nature Methods》評為年度技術。同年,《Science》將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。同時隨著技術發(fā)展更新,單細胞測序技術由早期的高成本、低通量及低自動化發(fā)展到目前的低成本、高通量、高自動化,臨床應用得到飛速發(fā)展,能夠快速確定成千上萬個細胞的精確基因表達模式,分析每個細胞的遺傳異質性。單細胞測序技術發(fā)展至今僅10余年,在神經(jīng)生物學、腫瘤研究、產(chǎn)前基因診斷等多個領域發(fā)揮重要作用,早已成為科學研究領域當之無愧的焦點。